34 CADERNOS DE ANÁLISE E PROSPETIVA CULTIVAR N.º 30 ABRIL 2024 – Melhoramento e técnicas genómicas variedade vegetal. Permitem igualmente identificar as variantes alélicas que transportam uma determinada característica, sendo possível identificar nas gerações seguintes a sua presença-ausência. Também possibilitam a identificação de uma variante alélica que poderá ser transferida por cisgénese para outra variedade da mesma espécie através de engenharia genética, sem qualquer alteração da sua sequência genómica (Figura 1). Figura 1 – Exemplo de cisgénese: alteração do material genético de uma variedade de maçã por transferência de uma variante alélica de uma maçã de outra variedade Fonte: Schouten et al. 20061 Ao mesmo tempo que se sequenciavam e exploravam os genomas vegetais, uma nova tecnologia começou a ser desenvolvida. Esta tecnologia baseia- -se na capacidade de desenvolver sistemas enzimáticos capazes de cortar as duas cadeias do DNA em locais específicos e assim criar condições para editar com precisão a sequência onde o corte é realizado. Desta forma, surgiram (e continuam a surgir) técnicas baseadas em moléculas que existem em determinados organismos que permitem realizar um desiderato fundamental: alterar o código genético de uma sequência conhecida, com total precisão, e assim modificar a sua função. Esta tecnologia é denominada de edição genética. Uma destas ferramentas, o CRISPR-Cas9, valeu a Emmanuelle Charpentier e Jennifer Doudna o Prémio Nobel da Química em 2020. A criação desta ferramenta tem uma história longa, em que ambas as investigadoras têm uma função determinante (Ref. 7). É esta tesoura molecular que está já a ser utili1 https://doi.org/10.1038/sj.embor.7400769 zada em todo o mundo para alterar de forma precisa genes ou sequências reguladoras da expressão génica, para se obterem plantas com características adequadas às nossas necessidades. Porque é que existe tanta esperança nesta tecnologia e nas que se lhe sucederão? A primeira razão é porque é possível decidir, com precisão, onde esta ferramenta deve atuar. Sabendo-se a função da sequência que se quer modificar, é possível alterar a característica que a ela está associada. A segunda razão é que é uma tecnologia barata, comparada com outras tecnologias de modificação genética. A terceira razão é a velocidade com que se obtém o produto desejado, mais rapidamente do que com outras tecnologias. A quarta é que, apesar de serem necessárias técnicas de engenharia genética, o produto final não conterá, no caso de se querer apenas silenciar um gene ou introduzir uma modificação pontual (um nucleótido), qualquer sequência de DNA estranha. Finalmente, sendo uma tecnologia relativamente simples poderá ser utilizada por empresas e centros de investigação para desenvolver variedades necessárias para desafios locais ou regionais. Como funciona esta ferramenta molecular? A Cas9 é uma enzima que tem dois centros ativos que se ligam um a cada uma das cadeias de DNA. Para além desta funcionalidade, a Cas9 tem também uma região à qual se pode ligar uma sequência de RNA (que se denomina de CRISPR). É possível desenhar a sequência de RNA de forma a que ela seja complementar a uma sequência específica do DNA que se quer modificar. Essa sequência tem que ter numa das suas extremidades uma pequena sequência denominada PAM (protospacer-adjacent motif), que tem que ter três “letras” na sua extremidade, em que duas delas são G (NGG) e a terceira é uma das outras três letras do código (A, T, C). Ao introduzir esta ferramenta molecular numa célula, o RNA que servirá de guia vai procurar a região complementar do DNA e ligar-se a esta região, Uma destas ferramentas, o CRISPR-Cas9 … está já a ser utilizada em todo o mundo para alterar de forma precisa genes ou sequências reguladoras da expressão génica, para se obterem plantas com características adequadas às nossas necessidades.
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